OPTOGENÉTICA

                    OPTOGENÉTICA

El cerebro y su estimulación selectiva

El cerebro es el órgano más complejo y representa la última frontera del conocimiento. En el humano está conformado por 85 mil millones de células gliales y más de 86 mil millones de neuronas¹; estas últimas están selectivamente conectadas entre sí, formando un gran conectoma funcional de ensambles neuronales, de cuya actividad eléctrica emergen todas las funciones cerebrales, desde el caminar hasta la conciencia misma. Enfermedades tan comunes como el Parkinson, el Alzheimer, la esquizofrenia y diversas adicciones, tienen su origen en disfunciones cerebrales. Por tal motivo, el estudio del funcionamiento del cerebro es fundamental para entender las causas de éstas y otras enfermedades, para comprender quiénes somos como especie humana y qué es lo que nos hace únicos como personas.

Las neuronas llevan a cabo su función a través de la generación de potenciales de acción, los cuales son la vía fundamental de transmisión de códigos neurales. La generación y propagación de los potenciales de acción requiere de la entrada de iones de sodio para despolarizar la membrana, seguida de una salida de iones de potasio para restablecer el potencial de membrana al repolarizarla. Para llevar a cabo la entrada y salida de iones es necesaria la participación de canales iónicos sensibles a voltaje que permiten la entrada de iones al interior de la neurona y a través de bombas que los transporten en contra de su gradiente electroquímico. Sin embargo, las neuronas no funcionan por sí solas, requieren de la activación conjunta de ensambles neuronales.

Para entender el funcionamiento de los circuitos neuronales es necesario poder activar o inhibir, con precisión temporal de milisegundo, a un grupo específico de neuronas con una función similar (e.g. a las neuronas relacionadas a la alimentación), sin afectar a otras neuronas encargadas de otras funciones (e.g. el control motor), las cuales pueden estar espacialmente entremezcladas. El control de la actividad neuronal de forma selectiva ha sido el reto tecnológico más importante y el sueño de muchos neurocientíficos. En la última década hemos sido testigos de grandes avances en el entendimiento del funcionamiento del cerebro; sin embargo, estos logros han sido limitados debido a la organización tan compleja del mismo. El cerebro contiene varios cientos de tipos distintos de neuronas (Figura 1A) que están entremezcladas entre sí, de tal forma que si estimulamos una región del cerebro con un microelectrodo, afectamos indiscriminadamente la actividad de diversos grupos neuronales que se localizan en el tejido², trayendo como consecuencia efectos secundarios indeseados. De igual forma, los tratamientos farmacológicos no nos ofrecen ni control tejido específico, ni control temporal³. Para resolver este problema se ha desarrollado una técnica de vanguardia llamada optogenética⁴. Cuando se activa un circuito neuronal de forma específica, nos permite demostrar si la actividad de esas neuronas es suficiente para generar una conducta, mientras que al inactivarlas se puede demostrar si su actividad es necesaria para generar una conducta determinada.

¿Qué es la optogenética?

La optogenética combina métodos ópticos (e.g. destellos de luz provenientes de un láser o un LED) con métodos genéticos para transferir a un grupo específico de neuronas el cDNA que codifica proteínas de origen microbiano sensibles a la luz (llamadas opsinas)^4-7. Ésta es una tecnología de vanguardia que inició su desarrollo en el 2005 por el Dr. Karl Deisseroth⁸ de la Universidad de Stanford; en el 2010 la revista Nature Methods lo nombró el método más importante del año⁹.

Las bases de la optogenética se encuentran en el estudio de un organismo unicelular, el alga Chlamydomonas reinhardtii, (Figura 1B) y su capacidad para moverse hacia una fuente de luz. Los doctores Peter Hegemann, el Dr. Georg Nagel, y el Dr. Ernst Bamberg, descubrieron una proteína llamada Channelrodopsina 2 (ChR2) de la cual esta alga se vale para desplazarse hacia la luz¹⁰. Ante la estimulación con una luz de 473nm (luz azul), el ChR2 se abre permitiendo el paso de iones a través del gradiente electroquímico de la célula (H+>Na+>K+>Ca+) (Figura 1C)⁸. Pocos años después del descubrimiento de la ChR2, el profesor Dr. Karl Deisseroth utilizó métodos de ingeniería genética y, con ayuda de promotores específicos, introdujo el gen de ChR2 en neuronas de roedores (Figura 1D), dado que de forma normal las neuronas no lo expresan; así que sólo las neuronas modificadas genéticamente pueden expresar el canal ChR2 por sí mismas. Después de 2 meses las neuronas expresaron niveles suficientes de ChR2 en el soma y dendritas (Figura 1E) para permitir que un simple pulso de luz azul, dirigido a través de una fibra óptica, abra el ChR2 y permita la entrada de Na+ al interior de la neurona, produciendo una despolarización del potencial de membrana y un potencial de acción (Figura 1F) sin afectar a las neuronas que se encuentran en el entorno y que no expresan el ChR2, ya que éstas no son sensibles al haz luminoso. Es decir, cuando el ChR2 se expresa en la membrana neuronal, éste puede literalmente transformar pulsos de luz en cambios en el potencial de membrana, desencadenando la generación de impulsos eléctricos o potenciales de acción^8,11.

La optogenética permite manipular la actividad de las neuronas con una precisión temporal de milisegundo gracias a la aplicación controlada de destellos luminosos y a la rápida cinética de activación-inactivación del ChR2. Para poder controlar la actividad neuronal es necesario que las neuronas expresen en toda su membrana el canal ChR2 y para lograrlo se utilizan sistemas lentivirales o adenovirales con la capacidad de infectar e incorporar el material genético necesario para que las neuronas expresen dicho canal⁶ o bien, utilizar animales transgénicos que expresen constitutivamente a las opsinas como parte de su genoma^12,13. El canal rodopsina 2 se puede expresar en niveles altos sin que afecte la viabilidad o fertilidad de los animales y sin perturbar de manera significativa las propiedades biofísicas de las neuronas. El ratón transgénico Thy-1::ChR2 expresa constitutivamente la ChR2 principalmente en neuronas glutamatérgicas de corteza y la activación optogenética de las neuronas de la corteza motora de este ratón sorprendentemente induce locomoción¹¹.

 Las herramientas de optogenetica pueden clasificarse en dos grandes categorías: los canales sensibles a la luz⁸, que inducen despolarización de la neurona, y una segunda clase que hiperpolariza a la neurona⁵. Estas opsinas son componentes únicos (no requieren de la adición de cofactores) sensibles a la luz, ya sean canales permeables a iones (e.g. ChR2) o bombas de aniones (NpHR) con cinéticas de activación-inactivación en el rango de milisegundo¹⁴. Para lograr la activación es necesario introducir a las neuronas el canal permeable a iones Channelrhodopsin-2 (ChR2), mientras que para silenciar la actividad neuronal se logra mediante la inserción de un gen de una halorodopsina la cual codifica para una bomba de Cl-. La halorodpsina más utilizada es la NpHR y proviene del alga Natronomonas pharaonis, que al ser estimulada -en esta ocasión con luz amarilla- permite el paso de Cl- al interior de la neurona logrando hiperpolarizarla, inhibiendo así su actividad¹⁵. De tal forma que el uso en conjunto de ChR2 y NpHR permite un control bidireccional de la actividad neuronal.

Aplicaciones futuras y presentes de la optogenética

La mayor aportación de la optogenética es, por supuesto, científica, ya que permite determinar el efecto causal y funcional entre la actividad de un grupo de neuronas definidas genéticamente y su efecto en la conducta. Este método servirá para identificar a las poblaciones celulares implicadas en diversos padecimientos y apoyará en la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos. Además, el método en sí mismo promete utilidad terapéutica; por ejemplo, el grupo de neuronas que responde al tratamiento del Parkinson mediante estimulación eléctrica profunda, fue recientemente identificado con estrategias optogenéticas¹⁶. Además, la optogenética ha servido para controlar ataques epilépticos en modelos animales experimentales¹⁷. Asimismo, se ha descubierto el papel primordial que juegan las neuronas dopaminérgicas en generar conductas adictivas a la cocaína¹⁸ y otros grupos de neuronas que son importantes para potenciar o evitar la adicción a la cocaína¹⁹.

El control neuronal del sueño y vigilia ha podido ser manipulado a voluntad mediante la optogenética. La activación optogenética de las neuronas llamadas hipocretinas interrumpe el sueño de un animal profundamente dormido²⁰. En tanto que la inhibición optogenética de estas neuronas provoca un estado inmediato de sueño profundo en animales que estaban despiertos al momento de aplicar el estímulo luminoso²¹. Estos hallazgos han sentado las bases para desarrollar fármacos que modulen el sueño y para el tratamiento de transtornos del sueño, como la narcolepsia²².

El inicio de la alimentación voluntaria depende de varios factores entre los cuales se incluye el sabor de la comida, su valor hedónico y el estado metabólico del sujeto²³ y, aunque se han descrito péptidos y hormonas que regulan el apetito²⁴, los mecanismos neurales que regulan la alimentación no han sido completamente elucidados. Recientemente, con la ayuda de métodos optogenéticos, se pudo activar selectivamente a un grupo de neuronas del hipotálamo en el núcleo arcuato, las cuales co-expresan AGRP/NPY. La activación de estas neuronas por sí solas fue suficiente para inducir un apetito voraz, incluso en animales saciados y sin necesidad de previo entrenamiento, demostrando que una conducta compleja como la alimentación puede ser controlada optogenéticamente. Por otra parte, la activación de otro grupo de neuronas, que expresan POMC- localizadas en la misma región del cerebro, reduce el apetito y produce pérdida de peso corporal en menos de 24 horas²⁵. Estos resultados son muy prometedores y generan enormes expectativas en torno a nuevos tratamientos para disminuir el sobrepeso. Sin duda, el desarrollo de la optogenética será una pieza clave para identificar a otros grupos neuronales que puedan disminuir el apetito e inducir pérdida de peso con la finalidad de poder identificar nuevos y más eficientes blancos farmacológicos para el control y tratamiento integral de la obesidad²⁶.

Células ajenas al sistema nervioso central también pueden ser manipuladas optogenéticamente con fines de estudio y en terapias experimentales. Estos métodos han permitido recuperar la vista a ratones ciegos²⁷. Por otro lado, la función cardiaca es potencialmente controlable mediante optogenética, de tal forma que si una arritmia ocurre, a través de un pulso de luz azul el corazón nuevamente puede bombear sangre al ritmo de la luz⁹. Este descubrimiento tiene el potencial para generar el primer marcapaso basado en la optogenética. También se han realizado con éxito los primeros experimentos de optogenética en primates no humanos²⁸. Así pues, los descubrimientos han sido numerosos en tan poco tiempo y sus aplicaciones vastas, lo que convierte a la optogenética como una herramienta de investigación bastante poderosa con un futuro resplandeciente en las neurociencias.

Figura 1. El cerebro está conformado por distintos grupos neuronales entremezclados entre sí (A) lo que ha dificultado estudiar su funcionamiento, en respuesta a este problema, a partir del 2005 se desarrolló una técnica llamada optogenética que nos permite el estudio de la función de grupos neuronales definidos genéticamente sin afectar la respuesta de otros adyacentes. El desarrollo de la optogenética comenzó con el estudio de un canal sensible a la luz perteneciente al alga chlamydomonas reinhardtii (B) el canal, conocido como channelrhodopsin 2 (ChR2). El ChR2 al ser estimulado con luz azul permite el paso de iones al interior de la neurona (C), y si el cDNA de esta opsina se introduce a las neuronas (D), comúnmente por medio de sistemas lentivirales o adenovirales con promotores específicos, de tal forma que sólo las neuronas que incorporaron el DNA a su genoma serán capaces de expresar ChR2 en su soma y dendritas (E). En el panel (F) se puede ver que la estimulación con luz azul de las neuronas que expresan ChR2 produce un potencial de acción (ver dendritas en color blanco). Modificado de Ed Boyden TEDtalk²⁹.

Referencias

1. Herculano-Houzel, S. (2009) The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.

Front Hum Neurosci. 3:31.

2. Histed, M.H., V. Bonin, and R.C. Reid. (2009) Direct activation of sparse, distributed

populations of cortical neurons by electrical microstimulation. Neuron. 63(4):508-22.

3. Gradinaru, V., et al. (2010) Molecular and cellular approaches for diversifying and extending

optogenetics. Cell. 141(1):154-65.

4. Deisseroth, K., et al. (2006) Next-generation optical technologies for illuminating genetically

targeted brain circuits. J Neurosci. 26(41):10380-6.

5. Gradinaru, V., K.R. Thompson, and K. Deisseroth. (2008) eNpHR: a Natronomonas

halorhodopsin enhanced for optogenetic applications. Brain Cell Biol. 36(1-4):129-39.

6. Zhang, F., et al. (2010) Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing

mammalian brain structures. Nat Protoc. 5(3):439-56.

7. Zhang, F., et al. (2006) Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat Methods.

3(10):785-92.

8. Boyden, E.S., et al. (2005) Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural

activity. Nat Neurosci. 8(9):1263-8.

9. Deisseroth, K. (2011) Optogenetics. Nat Methods. 8(1):26-9.

10. Nagel, G., et al. (2003) Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane

channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100(24):13940-5.

11. Gradinaru, V., et al. (2007) Targeting and readout strategies for fast optical neural control in

vitro and in vivo. J Neurosci. 27(52):14231-8.

12. Wang, H., et al. (2007) High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in

Channelrhodopsin-2 transgenic mice. Proc Natl Acad Sci USA. 104(19):8143-8.

13. Arenkiel, B.R., et al. (2007) In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic

mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54(2):205-18.

14. Zhang, F., et al. (2007) Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature.

446(7136):633-9.

15. Zhang, F., et al. (2007) Circuit-breakers: optical technologies for probing neural signals and

systems. Nat Rev Neurosci. 8(8):577-81.16. Gradinaru, V., et al. (2009) Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science.

324(5925): p. 354-9.

17. Tonnesen, J., et al. (2009) Optogenetic control of epileptiform activity. Proc Natl Acad Sci USA.

106(29):12162-7.

18. Tsai, H.C., et al. (2009) Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral

conditioning. Science. 324(5930):1080-4.

19. Lobo, M.K., et al. (2010) Cell type-specific loss of BDNF signaling mimics optogenetic control

of cocaine reward. Science. 330(6002):385-90.

20. Adamantidis, A.R., et al. (2007) Neural substrates of awakening probed with optogenetic

control of hypocretin neurons. Nature. 450(7168):420-4.

21. Tsunematsu, T., et al. (2011) Acute Optogenetic Silencing of Orexin/Hypocretin Neurons

Induces Slow-Wave Sleep in Mice. J Neurosci. 31(29):10529-10539.

22. Kroeger, D. and L. de Lecea. (2009) The hypocretins and their role in narcolepsy. CNS Neurol

Disord Drug Targets. 8(4):271-80.

23. Gutierrez, R. and S.A. Simon. (2011) Chemosensory processing in the taste. Reward pathway.

26(4):231-238.

24. Cegla, J., T.M. Tan, and S.R. Bloom. (2010) Gut-brain cross-talk in appetite regulation. Curr

Opin Clin Nutr Metab Care. 13(5):588-93.

25. Aponte, Y., D. Atasoy, and S.M. Sternson. (2011) AGRP neurons are sufficient to orchestrate

feeding behavior rapidly and without training. Nat Neurosci. 14(3):351-5.

26. Gutierrez, R., et al. (2011) Neural integration of reward, arousal, and feeding: Recruitment of

VTA, lateral hypothalamus, and ventral striatal neurons. IUBMB Life. 63(10):824-30.

27. Chow, B.Y., et al. (2011) Synthetic physiology strategies for adapting tools from nature for

genetically targeted control of fast biological processes. Methods Enzymol. 497:425-43.

28. Diester, I., et al. (2011) An optogenetic toolbox designed for primates. Nat Neurosci. 14(3):387-

97.

29. Boyden, E. (2011) A ligth switch for neurons. cited 2011 May-2011]; Available from:

http://www.ted.com/talks/ed_boyden.html.

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