Avibacterium paragallinarum CARACTERISTICAS Y CULTIVO

                          Avibacterium paragallinarum CARACTERISTICAS Y CULTIVO

Antes conocido como Haemophilus gallinarum, Haemophilus paragallinarum y actualmente  Avibacterium paragallinarum  A.p. es una bacteria gram negativa dificíl de cultivar, crece bien en la yema del saco vitelino  de embriones incubados a los 5 o 6 días.

 Para hacer un cultivo necesitaremos un caldo que  contenga por lo menos un 20% de peptonas de carne, un .5 % de extracto de carne, dextrosa 2.5%, 5% de Cloruro de Sodio y un 2.5% de difosfato de sodio, el cultivo también requiere de suero de aves o de caballo en un 1% y una enzima, Nicotinamida Adenina  Dinucleótido forma reducida NAD 5microgramos por ml de caldo.

Como vemos es un medio especial que no se encuentra en el mercado y que tenemos que diseñar,

Además nuestro cultivo debe hacerse en un fermentador  o reactor que proporcione la temperatura de 37 grados centígrados y que mantenga menos de 600 revoluciones por minuto RPM..Las técnicas de Bioingeniería no vienen en este artículo

Eso en caso de buscar una gran cantidad para producción de bacterina, pero si solo hacemos un cultivo en agar sangre con una tira de Estaphilococcus albus,  (Nodriza) en estos casos  observamos el fenómeno de satelitismo y en Agar Infusion de Corazón y Cerebro con NAD. si observamos el cultivo a través de una fuente de luz se observa la iridiscencia, en tonos magenta.
Las colonias que están mas cercanas a la nodriza, son mas grandes, todas son como finas gotas de rocío.

Los aislamientos  se hacen de los senos nasales, en un corte en forma de un pequeño triángulo, encontraremos un moco transparente y abundante que se obtiene con un hisopo y se siembra en  el agar  cuando se seca colocamos la nodriza, el agar así sembrado se incuba dentro de un frasco de boca ancha con una vela cuya combustión al cerrar el frasco agota el contenido de oxígeno de esta forma se consigue que el cultivo crezca con una baja cantidad de oxígeno, los cultivos se obtienen en menos de 24horas y son representativas de un diagnóstico positivo a Coriza Aviar.

No de cualquier aislamiento podemos hacer una bacterina. El hacer una bacterina efectiva requiere de incluir los tres serotipos A,ByC.el manejo, de estos serotipos y su conservación lo podemos explicar, con un esquema  anexo de cómo debe tratarse cada serotipo, para siempre tener el mismo estándar de antigenicidad.En cuanto a mi experiencia en el cultivo de  Actinobacillus paragalinarum (Hemophilus paragallinarum), se hicieron pruebas con diferentes medios de marca y no encontramos ninguno efectivo y de bajo precio, he usado por mas de 20 años la siguiente fórmula:

Primagen                    20.0 g..  Medio de cultivo de tejidos

Extracto de Carne        5 g.    Difco

Cloruro de Sodio         5.0 g.

Difosfato de Sodio      2.5 g.
Dextrosa                     2.5 g.

Agua bidestilada  cbp 1000 ml.

Este medio debe ajustarse a un Ph de 7.2

Esterilizar a 120 grados Celsius, a un kilo de presión, por 20 minutos.

El suero de pollo y el  beta Nicotinamida Dinuclotido  sal disódica en forma reducida (NADP, Coenzima II) N 605  Sigma  Chemical Co. se esterilizan por filtración se hacen las pruebas de esterilidad y se usan lo más rápido posible porque tiene  enzimas inhibidoras que reducen su potencia.

El suero y el NAD se agregan al caldo de cultivo en condiciones de esterilidad seguras, el cultivo tiene un tiempo de generación de 18 minutos

Para conseguir el suero de pollo se compra en el rastro de aves, 20 a 30 litros de sangre, que se colocan  en un colador hecho ex profeso para filtrar los coágulos y se deja por 24 horas a una temperatura de 5 grados Celsius ( cuarto frío)
 El filtrado se inactiva a 57 grados C. por 20 minutos a baño maría; se enfría a 5 grados para poder clarificarlo.

El filtrado se clarifica por centrifugación en una centrífuga hecha para éste propósito que tenga canastillas para un frasco de 500 ml. cada una,  por  30 minutos, en seguida se pasa  el sobrenadante por un filtro prensa que contenga  tela Pellyon y Decalite,( Medios filtrantes), después de dos o tres pasadas el suero debe estar claro y brillante con un aspecto parecido al vino tinto.

Para esterilizar  el suero, se filtra por unos cartuchos de 0.4 micras a 0.2, nominal y después por una membrana filtrante  absoluta de 0.4 y 0.2 micras en serie, todas de la marca Sartorius. Filtros que se consiguen esterilizados y listos para su uso.

Hay otras marcas, pero después de varias pruebas de validación, la marca Sartorius, resultó ser la mas segura en cuanto a control de calidad.

EL PRINCIPIO DE LA TRANSFORMACIÓN CON Avibacterium paragallinarum

                                           

                                   

Cuando todavía no se conocía la molécula inteligente, que es como algunos genetistas llaman al ADN, desde antes de 1928 se hicieron muchos experimentos para dar con el material  que hacía que las células se replicaran y heredaran las características de sus progenitoras, en ésta época Frederick Griffith utilizó la información de que algunos  neumococos  podían mutar de cepas lisas a rugosas y viceversa e hizo una serie de experimentos con neumococos virulentos y avirulentos.

Inoculó Neumococos tipo III virulentas muertas por el calor a un grupo de ratones. a otro grupo aplicó Neumococos  tipo II avirulentas y a un tercer grupo una mezcla de los dos.

El resultado fue que los dos primeros grupos no enfermaron; y a los ratones del tercer grupo, murieron todos lo que demostraba que el material genético había pasado de los neumococos vivos tipo II a los muertos tipo III, a éste fenómeno se le conoció primero como efecto Griffith y mas tarde, TRANSFORMACIÓN

Hubo otros investigadores que perfeccionaron estos experimentos al combinar células rugosas de neumococo tipo II, con células lisas de tipo III. Con estos experimentos se demostró el paso de material genético de las células vivas a las muertas, éste fenómeno no es exclusivo de los neumococos ahora se sabe que ocurre entre géneros diferentes, por ejemplo entre Haemophilus, Pasterella, Bacillus subtilis, Shigella etc

De tal manera que  aprovechando que Pasterella y Avibacterium  tienen  ciertas características comunes, es posible conseguir cepas de Avibacterium que no necesiten el DPN ni el suero y que conserven su antigenicidad y su patogenicidad, sin hacer uso de la ingeniería genética lo importante es armarnos de mucha paciencia y trabajar  muy duro para encontrar lo que buscamos.

Conseguiríamos por ejemplo. una cepa vacunal de Pasterella, la cepa CU, la sometemos al calor, comprobando que ha quedado inactivada o muerta, la mezclamos con una serotipo de Avibacterium.,  hacemos una siembra en un medio como el agar Infusión de Corazón y Cerebro que no contenga Suero ni DPN, quizá en algunos casos no tendremos crecimiento pero con un suerte podemos encontrar algunas colonias en toda la caja petri del cultivo. Ahora viene el trabajo de tomar cada colonia y suspenderla en un tubo que contenga Infusión de Corazón y Cerebro, los tubos que muestren crecimiento deben tomarse por separado e inocular 5 pollitas de 6 semanas que estén sanas y libres de cualquier vacuna, es posible que en un 1% encontremos un cultivo que replica las lesiones de coriza aviar, de éstas se aislará de nuevo el Avibacterium, tomando como referencia el cuadro antes publicado de cómo mantener un serotipo estable y útil para semilla.
En México y otros países se han aislado naturalmente serotiipos, que no necesitan NAD





























































Bibliografía:

Principios de Genética,. Jhon Wiley 1988

Edgardo Soriano-Vargas Josué Sánchez-Morales  Vladimir Morales-Erasto  Alejandra Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma del Estado de México

Microbiología Veterinaria Carter.

Isolation And Identification Of Avian Pathogens Editorial commitee for The American Association of Avian Pathologist Texas A & University College Station

The Production And Use Of  Newcastle Disease Vaccines. W.H. Allan, J.E Lancaster and B. Tóth

Food and Agriculture Organization Of The United Nations FAO

Perincipios de Genética,. Jhon Wiley 1988

MV. Carlos Rodríguez G. Labs. Biofarma, Investigación Personal