ADYUVANTS FOR CORYZA BACTERIN

                                             ADYUVANTS FOR CORYZA BACTERIN

An adjuvant is any chemical substance which retards the absorption of a vaccine to

enhance the immune effect, should be well tolerated by the tissues and should not leave deposits that cause injury or confiscation of the animal on the trail.

BIOFARMA MÉXICO

Bacterins prepared in chick embryo yolk and containing liquids of an embryo 6 days old, can be said that the tip serves as adjuvant for having a large amount of lipids delaying absorption, but in addition also contains the yolk sac a lot of immunoglobulins IGG, similar in amount to the horse serum content, so if you're using fertile eggs of birds that had Mycoplasma, or other disease, most likely will also be using the bacterin to control coryza, incidentally are applying antibodies to Mycoplasma or some other viral disease according to Michael W. Z. Naveh and Eliora Ron.

Coryza bacterin developed in chicken embryo using absorbed subcutaneously always, you can revaccinate once or twice during aging and sometimes I had seen that arrested the disease, I can not say that the cure but something style, however it would be safe to say that happens often.

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Bacterin has a drawback that can not be mixed with other vaccines as with bacterins using mineral oil, there was a time that the first  broth bacterin developed as aluminum hydroxide adjuvant at a ratio up to 20% by volume, soon fell into disuse.

Now there are several brands of mineral oil emulsion bacterins, combined with up to 2 more vaccines, which makes me doubt their effectiveness.

Considering it takes 300 ml. of Avibacterium concentrate more the two vaccines, mineral oil Tween and Span, sometimes makes shoddy emusiones see that soon separated and applying them can   reaches  to produce tissue necrosis where the inyection was given, or are causing a bad where it should be the opposite.

I would not give a precise formula of a bacterin emulsified, there are many variables at play, for example, oil viscosity and purity, the use of Tween and Span as surfactants and last but not least the quality of the emulsifier, not easily be achieved.

My apologies for not giving a specific formula in this case is necessary to do some testing in coordination with  the people that supply oil or surfactants.

Adjuvants are substances or preparations which, incorporated into the antigen or injected simultaneously therewith, makes it more effective immune response. With an economy of use of antigen and time is achieved, and a higher level of specific antibodies.

The mechanism of action of these substances has been the subject of numerous studies and, apparently, there are several factors that explain its mode of action. Free antigen normally diffuses rapidly from the local tissues surrounding the site of inoculation, and one of its major functions is to create a reservoir or depot   antigen long life.

  Research has shown that virtually all adjuvants activate or stimulate macrophages; when activated, they stimulate the immune response by increasing the amount of antigen expressed on the cell membrane and the efficiency of the presentation to lymphocytes. The macrophage stimulating also releases soluble factors which amplify the proliferation of lymphocytes. Furthermore, some adjuvants have the ability to act specifically on lymphocytes; but in general, they work best if they facilitate simultaneous release of antigen and immunomodulatory substances lymphoid tissue.

At the international level, the list of natural products derived from chemical synthesis, adjuvant / immunopotentiating properties, is increasing; however, only a small number is used in the formulation of veterinary and human vaccines, there is a trend related to the assessment of new substances for this purpose. Depending on the scope and efficiency / safety ratio can recognize different categories of adjuvants (Table), which will be examined in more detail.

Table.   Relationship between applications of adjuvants and the ratio efficiency / safety

	The efficiency is more important		Safety is more
	that security		important than efficiency
Adjuvants	Animals	Animals for	Animals
	laboratory	feeding	Company	Human
FCA	+	-	-	-
Emulsions	+	+	(-)	-
oil / water
Emulsions	+	+	-	-
water / oil
Rigid materials	+	(+)	(+)	(-)
Aluminum compounds	+	+	+	+
Liposomes	+	+	(+)	(-)
Saponins	+	(+)	(+)	(-)
DDA	+	(+)	(+)	(-)
NBP	+	(+)	(+)	(-)

In this field, the efficiency is a very important element and certain levels of side effects are tolerated. The most widely used adjuvants in veterinary vaccines are mineral oil emulsions (oil-in-water or water in oil) and the adsorbent (hydroxide and aluminum phosphate). In some cases, liposomes are employed, saponins, vitamin E, immunostimulating complexes (ISCOMs _s) and different emulsions of oils of vegetable or animal origin. Mineral oil emulsions, particularly water-in-oil, while inducing a strong immune response can cause unwanted risks and effects, possibly because of their limited biodegradability and biocompatibility. ¹⁰  

For this reason, there have been numerous attempts to develop effective adjuvants while insurance. One example is the formulation consisting of synthetic sulfolipopolisacárides with hydrophobic characteristics, incorporated into an emulsion of squalene in water, developed by the Belgian company Solvay SA. This adjuvant has been successfully validated in laboratory animals with protein and viral antigens, and is, to   least as effective as the mineral oil based adjuvants   employed nowadays

  in various veterinary vaccine

Immunomodulatory properties have been demonstrated in many natural polysaccharides and some derivatives obtained by hydrolysis or chemical modification. The hematopoiesis stimulating activity of the humoral and cellular immune response and is one of the most significant features of the glucans isolated from the cell wall of Yeast.Has been shown by different authors that simultaneous administration of glucan and an antigen stimulates formation Specific antibodies against the antigen in question; proof is glucans stimulation of humoral and cell-mediated   Francisella tularensis   and   Pseudomonas   pseudomallei. Furthermore, described the stimulation of antibody synthesis   Entamoeba histolytica   in guinea pigs after administration of the glucan and is recognized on the adjuvant effect   Leishmania major, Mycobacterium leprae, Candida albicans, Herpes simplex   and murine hepatitis virus.

Furthermore, oral administration of an extract of glucans (Glucanil) of   Candida albicans   ATCC 20995, supplied to mice 10 days prior to experimental infection with   Candida albicans and Staphylococcus aureus,   significantly increased resistance to systemic infection with these microorganisms and toxicology studies have revealed that the product was highly tolerated.

In some experiments, the activity of the glucan was superior to that of commonly used adjuvants. The effect depends on the mode glucan administration, although the latter may be performed repeatedly, the stimulatory effect usually occurs after a single injection.

REFERENCES

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19.             

Humberto Quevedo Joaquin Morris, Mrs. Clara Martínez Manrique, Mr. Robert T. Abdala Díaz and Mr. Campos Orama Denia. Adjuvants, Immunologic

Passive Immune Protection: A Reevaluation Michael W. Eliora Z. Naveh and Ron. Department    of    Molecular Microbiology and Biotechnology. Tel Aviv Univesity, Tel Aviv, Israel

  20     Experiences of the author

Bibliography

Immune Passive Protection: A Reevaluation Michael W. Z. Naveh and Eliora Ron Department of Molecular Microbiology and Biotechnology. Tel Aviv Univesity, Tel Aviv, Israel

Experiences of the author

ADYUVANTES PARA LA BACTERINA DE CORIZA

                             

                       ADYUVANTES PARA LA BACTERINA DE CORIZA

Un adyuvante es toda sustancia química que retarda la absorción de una vacuna para

potenciar el efecto inmunológico, debe ser bien tolerado por los tejidos y no deberá dejar depósitos que causen una lesión o el decomiso del animal en el rastro.

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Las bacterinas elaboradas en embrión de pollo, contienen la yema y los líquidos de un embrión de 6 días de edad, puede decirse que la yema sirve como adyuvante por tener una gran cantidad de lípidos que retardan la absorción, pero además el saco vitelino también contiene una gran cantidad de inmunoglobulinas IGG, semejantes en cantidad al contenido del suero de caballo, así que si estamos usando huevo fértil de aves que tuvieron Mycoplasma, u otra enfermedad, lo más probable será que además de estar usando la bacterina para el control de la Coriza, de paso estamos aplicando anticuerpos a Mycoplasma o alguna otra enfermedad viral según Michael W. Naveh and Eliora Z. Ron.

La bacterina de Coriza desarrollada en embrión de pollo se ab

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sorbe fácilmente usando siempre la vía subcutánea, se puede revacunar una o dos veces durante la crianza y en algunas ocasiones me tocó observar que detenía la enfermedad, no puedo decir que la curaba pero algo por el estilo, sin embargo sería muy aventurado decir que suceda frecuentemente.

La bacterina tiene el inconveniente de que no se puede mezclar con otras vacunas como sucede con las bacterinas que utilizan aceite mineral, hubo un tiempo que las primeras bacterinas desarrolladas en caldo llevaban como adyuvante el Hidróxido de Aluminio en una proporción de hasta el 20% por volumen, pronto cayeron en desuso.

Ahora se encuentran varias marcas de bacterinas  emulsionadas en aceite mineral, combinadas emulsionadas en aceite mineral,  combinadas con hasta 2 vacunas más, estas, han demostrado poca eficacia..

Si tomamos en cuenta que se necesita 300 ml. de un concentrado de Avibacterium mas las dos vacunas, el aceite mineral el Tween y el Span, hace que a veces veamos emusiones mal hechas que en poco tiempo se separan y que al aplicarlas pueden  llegar a producir necrosis del tejido.

En la emulsión agua y aceite, que es la más común, tenemos 300 ml. de concentrado de los tres serotipos.
con tween y span mas la cantidad suficiente para completar un ltro, la mezcla debe hacerse en un emulsificador a 16 000 revoluciones por minuto. la emulsión lleva ademas Timerosal y se deja una muestra de 100 ml. como muestra de retención para las pruebas de control de calidad.

Los adyuvantes son sustancias o preparados químicos que, incorporados al antígeno o inyectados simultáneamente con él, hacen más efectiva la respuesta inmune. Con su empleo se logra una economía de antígeno y de tiempo, así como un mayor nivel de anticuerpos específicos.
El mecanismo de acción de estas sustancias ha sido objeto de numerosos estudios y, al parecer, existen diversos factores que explican su modo de acción. El antígeno libre normalmente difunde con mucha rapidez desde los tejidos locales que rodean el sitio de inoculación, y una de sus funciones importantes es crear un reservorio o depósito del antígeno de larga vida.
 Las investigaciones realizadas han demostrado que virtualmente todos los adyuvantes activan o estimulan los macrófagos; éstos cuando son activados estimulan la respuesta inmune por un incremento de la cantidad de antígeno expresado en la membrana celular y de la eficiencia de su presentación a los linfocitos. El macrófago también libera factores solubles estimulantes, que amplifican la proliferación de los linfocitos. Por otro lado, algunos adyuvantes poseen la capacidad de actuar específicamente sobre los linfocitos; pero, en general, éstas funcionan mejor si facilitan la liberación simultánea del antígeno y de sustancias inmunomoduladoras al tejido linfoide.
En el nivel internacional, la lista de productos naturales y derivados de la síntesis química, con propiedades adyuvantes/inmunopotenciadoras, es cada vez mayor; sin embargo, sólo un reducido número se utiliza en la formulación de vacunas veterinarias y humanas, existiendo una tendencia relacionada con la evaluación de nuevas sustancias con esta finalidad. En función del campo de aplicación y de la relación eficiencia/seguridad se pueden reconocer diferentes categorías de adyuvantes (tabla),que serán examinadas a continuación con más detenimiento.

Tabla. Relación entre las aplicaciones de los adyuvantes y la relación eficiencia/seguridad

	La eficiencia es más importante		La seguridad es más
	que la seguridad		importante que la eficiencia
Adyuvantes	Animales	Animales para	Animales
	de laboratorio	la alimentación	de compañía	Humanos
FCA	+	-	-	-
Emulsiones	+	+	(-)	-
aceite/agua
Emulsiones	+	+	-	-
agua/aceite
Materiales inertes	+	(+)	(+)	(-)
Compuestos de aluminio	+	+	+	+
Liposomas	+	+	(+)	(-)
Saponinas	+	(+)	(+)	(-)
DDA	+	(+)	(+)	(-)
NBP	+	(+)	(+)	(-)

En este campo, la eficacia es un elemento de gran importancia y se toleran ciertos niveles de efectos colaterales. Los adyuvantes más ampliamente utilizados en las vacunas veterinarias son las emulsiones de aceite mineral (del tipo aceite en agua o agua en aceite) y los adsorbentes (hidróxido y fosfato de aluminio). En algunos casos, se emplean liposomas, saponinas, vitamina E, complejos inmunoestimulantes (ISCOM_s), así como diferentes emulsiones de aceites de origen vegetal o animal. Las emulsiones de aceite mineral, especialmente las del tipo agua en aceite, si bien inducen una fuerte respuesta inmune, pueden provocar riesgos y efectos no deseados, a causa posiblemente de su limitada biodegradabilidad y biocompatibilidad.¹⁰

Por tal razón, se han realizado numerosos intentos para desarrollar adyuvantes eficaces y a la vez seguros. Ejemplo de ello es la formulación compuesta por sulfolipopolisacáridos sintéticos, con características hidrofóbicas, incorporados a una emulsión de escualeno en agua, desarrollada por la compañía belga Solvay SA. Este adyuvante ha sido validado exitosamente en animales de laboratorio con antígenos proteicos y virales, y resulta, al menos, tan efectivo como los adyuvantes basados en aceite mineral empleados hoy día

 en diversas vacunas veterinarias

Las propiedades inmunomoduladoras han sido demostradas en numerosos polisacáridos naturales y algunos derivados obtenidos por hidrólisis o modificación química. La actividad estimulante de la hematopoyesis y de la respuesta inmune humoral y celular es uno de los rasgos más significativos de los glucanos aislados de la pared celular de levaduras.Ha sido mostrado por diferentes autores que la administración simultánea del glucano y un antígeno estimula la formación de anticuerpos específicos contra el antígeno en cuestión; prueba de ello es la estimulación por los glucanos de la respuesta humoral y mediada por células contra Francisella tularensis y Pseudomonas pseudomallei. Además, se ha descrito la estimulación de la síntesis de anticuerpos contra Entamoeba histolytica en curieles después de la administración del glucano y se ha reconocido el efecto adyuvante en Leishmania major, Mycobacterium leprae, Candida albicans, Herpes simplex y el virus de la hepatitis murina.

Por otra parte, la administración oral de un extracto de glucanos (Glucanil) de Candida albicans ATCC 20995, suministrado a ratones 10 días antes de la infección experimental con Candida albicans y Staphylococcus aureus, incrementó significativamente la resistencia a la infección sistémica con estos microorganismos y los estudios toxicológicos revelaron que el producto era altamente tolerado.
En algunos experimentos, la actividad del glucano resultó superior a la de adyuvantes usados comúnmente. El efecto del glucano depende del modo de administración, y aunque este último puede ser realizado de forma repetida, el efecto estimulatorio suele ocurrir después de una inyección única.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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19. 
    
    Lic. Humberto Joaquín Morris Quevedo, Lic. Clara Martínez Manrique, Lic. Roberto T. Abdala Díaz e Ing. Denia Campos Orama. Adyuvantes Inmunológicos
    Passive Immune Protection: A Reevaluation Michael W. Naveh and Eliora Z. Ron. Departament  of  Molecular Microbiology and Biotechnology. Tel Aviv Univesity, Tel Aviv, Israel

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Avibacterium paragallinarum CARACTERISTICAS Y CULTIVO

                          Avibacterium paragallinarum CARACTERISTICAS Y CULTIVO

Antes conocido como Haemophilus gallinarum, Haemophilus paragallinarum y actualmente  Avibacterium paragallinarum  A.p. es una bacteria gram negativa dificíl de cultivar, crece bien en la yema del saco vitelino  de embriones incubados a los 5 o 6 días.

 Para hacer un cultivo necesitaremos un caldo que  contenga por lo menos un 20% de peptonas de carne, un .5 % de extracto de carne, dextrosa 2.5%, 5% de Cloruro de Sodio y un 2.5% de difosfato de sodio, el cultivo también requiere de suero de aves o de caballo en un 1% y una enzima, Nicotinamida Adenina  Dinucleótido forma reducida NAD 5microgramos por ml de caldo.

Como vemos es un medio especial que no se encuentra en el mercado y que tenemos que diseñar,

Además nuestro cultivo debe hacerse en un fermentador  o reactor que proporcione la temperatura de 37 grados centígrados y que mantenga menos de 600 revoluciones por minuto RPM..Las técnicas de Bioingeniería no vienen en este artículo

Eso en caso de buscar una gran cantidad para producción de bacterina, pero si solo hacemos un cultivo en agar sangre con una tira de Estaphilococcus albus,  (Nodriza) en estos casos  observamos el fenómeno de satelitismo y en Agar Infusion de Corazón y Cerebro con NAD. si observamos el cultivo a través de una fuente de luz se observa la iridiscencia, en tonos magenta.
Las colonias que están mas cercanas a la nodriza, son mas grandes, todas son como finas gotas de rocío.

Los aislamientos  se hacen de los senos nasales, en un corte en forma de un pequeño triángulo, encontraremos un moco transparente y abundante que se obtiene con un hisopo y se siembra en  el agar  cuando se seca colocamos la nodriza, el agar así sembrado se incuba dentro de un frasco de boca ancha con una vela cuya combustión al cerrar el frasco agota el contenido de oxígeno de esta forma se consigue que el cultivo crezca con una baja cantidad de oxígeno, los cultivos se obtienen en menos de 24horas y son representativas de un diagnóstico positivo a Coriza Aviar.

No de cualquier aislamiento podemos hacer una bacterina. El hacer una bacterina efectiva requiere de incluir los tres serotipos A,ByC.el manejo, de estos serotipos y su conservación lo podemos explicar, con un esquema  anexo de cómo debe tratarse cada serotipo, para siempre tener el mismo estándar de antigenicidad.En cuanto a mi experiencia en el cultivo de  Actinobacillus paragalinarum (Hemophilus paragallinarum), se hicieron pruebas con diferentes medios de marca y no encontramos ninguno efectivo y de bajo precio, he usado por mas de 20 años la siguiente fórmula:

Primagen                    20.0 g..  Medio de cultivo de tejidos

Extracto de Carne        5 g.    Difco

Cloruro de Sodio         5.0 g.

Difosfato de Sodio      2.5 g.
Dextrosa                     2.5 g.

Agua bidestilada  cbp 1000 ml.

Este medio debe ajustarse a un Ph de 7.2

Esterilizar a 120 grados Celsius, a un kilo de presión, por 20 minutos.

El suero de pollo y el  beta Nicotinamida Dinuclotido  sal disódica en forma reducida (NADP, Coenzima II) N 605  Sigma  Chemical Co. se esterilizan por filtración se hacen las pruebas de esterilidad y se usan lo más rápido posible porque tiene  enzimas inhibidoras que reducen su potencia.

El suero y el NAD se agregan al caldo de cultivo en condiciones de esterilidad seguras, el cultivo tiene un tiempo de generación de 18 minutos

Para conseguir el suero de pollo se compra en el rastro de aves, 20 a 30 litros de sangre, que se colocan  en un colador hecho ex profeso para filtrar los coágulos y se deja por 24 horas a una temperatura de 5 grados Celsius ( cuarto frío)
 El filtrado se inactiva a 57 grados C. por 20 minutos a baño maría; se enfría a 5 grados para poder clarificarlo.

El filtrado se clarifica por centrifugación en una centrífuga hecha para éste propósito que tenga canastillas para un frasco de 500 ml. cada una,  por  30 minutos, en seguida se pasa  el sobrenadante por un filtro prensa que contenga  tela Pellyon y Decalite,( Medios filtrantes), después de dos o tres pasadas el suero debe estar claro y brillante con un aspecto parecido al vino tinto.

Para esterilizar  el suero, se filtra por unos cartuchos de 0.4 micras a 0.2, nominal y después por una membrana filtrante  absoluta de 0.4 y 0.2 micras en serie, todas de la marca Sartorius. Filtros que se consiguen esterilizados y listos para su uso.

Hay otras marcas, pero después de varias pruebas de validación, la marca Sartorius, resultó ser la mas segura en cuanto a control de calidad.

EL PRINCIPIO DE LA TRANSFORMACIÓN CON Avibacterium paragallinarum

                                           

                                   

Cuando todavía no se conocía la molécula inteligente, que es como algunos genetistas llaman al ADN, desde antes de 1928 se hicieron muchos experimentos para dar con el material  que hacía que las células se replicaran y heredaran las características de sus progenitoras, en ésta época Frederick Griffith utilizó la información de que algunos  neumococos  podían mutar de cepas lisas a rugosas y viceversa e hizo una serie de experimentos con neumococos virulentos y avirulentos.

Inoculó Neumococos tipo III virulentas muertas por el calor a un grupo de ratones. a otro grupo aplicó Neumococos  tipo II avirulentas y a un tercer grupo una mezcla de los dos.

El resultado fue que los dos primeros grupos no enfermaron; y a los ratones del tercer grupo, murieron todos lo que demostraba que el material genético había pasado de los neumococos vivos tipo II a los muertos tipo III, a éste fenómeno se le conoció primero como efecto Griffith y mas tarde, TRANSFORMACIÓN

Hubo otros investigadores que perfeccionaron estos experimentos al combinar células rugosas de neumococo tipo II, con células lisas de tipo III. Con estos experimentos se demostró el paso de material genético de las células vivas a las muertas, éste fenómeno no es exclusivo de los neumococos ahora se sabe que ocurre entre géneros diferentes, por ejemplo entre Haemophilus, Pasterella, Bacillus subtilis, Shigella etc

De tal manera que  aprovechando que Pasterella y Avibacterium  tienen  ciertas características comunes, es posible conseguir cepas de Avibacterium que no necesiten el DPN ni el suero y que conserven su antigenicidad y su patogenicidad, sin hacer uso de la ingeniería genética lo importante es armarnos de mucha paciencia y trabajar  muy duro para encontrar lo que buscamos.

Conseguiríamos por ejemplo. una cepa vacunal de Pasterella, la cepa CU, la sometemos al calor, comprobando que ha quedado inactivada o muerta, la mezclamos con una serotipo de Avibacterium.,  hacemos una siembra en un medio como el agar Infusión de Corazón y Cerebro que no contenga Suero ni DPN, quizá en algunos casos no tendremos crecimiento pero con un suerte podemos encontrar algunas colonias en toda la caja petri del cultivo. Ahora viene el trabajo de tomar cada colonia y suspenderla en un tubo que contenga Infusión de Corazón y Cerebro, los tubos que muestren crecimiento deben tomarse por separado e inocular 5 pollitas de 6 semanas que estén sanas y libres de cualquier vacuna, es posible que en un 1% encontremos un cultivo que replica las lesiones de coriza aviar, de éstas se aislará de nuevo el Avibacterium, tomando como referencia el cuadro antes publicado de cómo mantener un serotipo estable y útil para semilla.
En México y otros países se han aislado naturalmente serotiipos, que no necesitan NAD